دانشمندان یک اطلس میکروپروتئینی برای مطالعه بیماری آلزایمر ایجاد کرده‌اند

به گزارش مجله خبری نگار، محققان موسسه سالک، اطلسی از میکروپروتئین‌های مغز انسان تهیه کرده‌اند که می‌تواند به مطالعه پیری و بیماری‌های نورودژنراتیو کمک کند. دانشمندان پس از تجزیه و تحلیل بیش از ۶۰۰ نمونه بافت قشر پیشانی پس از مرگ، ۱۰۶۷ میکروپروتئین را شناسایی کردند که در پایگاه داده اصلی پروتئین وجود نداشتند. مشخص شد که یکی از این میکروپروتئین‌ها با متابولیسم انرژی در میکروگلیا - سلول‌های ایمنی در مغز که در ایجاد بیماری آلزایمر نقش دارند - مرتبط است. مقاله ایزوستیا توضیح می‌دهد که میکروپروتئین‌ها چه هستند و چرا دانشمندان برای دهه‌ها آنها را نادیده گرفتند.

میکروپروتئین‌ها چه هستند؟

تقریباً هر سلول در بدن انسان حاوی کد ژنتیکی یکسانی است. با این حال، سلول‌های مختلف از مناطق مختلفی از این کد برای تولید پروتئین‌هایی که عملکرد و ویژگی‌های آنها را تعیین می‌کنند، استفاده می‌کنند. به همین دلیل است که یک نورون با سلول قلب و یک سلول ایمنی با سلول ماهیچه‌ای متفاوت است.

پروتئین‌ها از زنجیره‌هایی از اسید‌های آمینه تشکیل شده‌اند. بسیاری از پروتئین‌های مورد مطالعه حاوی صد‌ها یا هزاران عدد از این عناصر هستند. میکروپروتئین‌ها معمولاً مولکول‌های بسیار کوتاه‌تری در نظر گرفته می‌شوند - در مطالعه جدید، این پروتئین‌ها بیش از ۱۵۰ اسید آمینه نداشتند.

با این حال، تشخیص میکروپروتئین‌ها به طور قابل توجهی دشوارتر از تشخیص پروتئین‌های بزرگتر است. در طول تجزیه و تحلیل پروتئومیک استاندارد، پروتئین‌ها به قطعاتی - پپتید‌ها - تجزیه می‌شوند که سپس توسط طیف‌سنج جرمی شناسایی می‌شوند. تأیید قابل اعتماد وجود یک پروتئین معمولاً نیاز به یافتن حداقل دو پپتید مشخصه دارد. یک مولکول کوتاه ممکن است به سادگی چنین قطعات مناسبی نداشته باشد.

در نتیجه، بسیاری از میکروپروتئین‌ها می‌توانند برای دهه‌ها خارج از پایگاه‌های داده علمی باقی بمانند، حتی اگر سلول‌ها به طور فعال آنها را تولید کنند.

آلن ساگاتلیان، استاد موسسه سالک و نویسنده ارشد این مطالعه، گفت: «ما هنوز مکانیسم‌های مولکولی پیری سالم را به طور کامل درک نکرده‌ایم. این امر به ویژه در مورد میکروپروتئین‌ها صادق است که سهواً برای دهه‌ها نادیده گرفته شده‌اند.»

به گفته وی، این اطلس جدید امکان مطالعه سیستماتیک میکروپروتئین‌ها در پیری و تخریب عصبی، از جمله بیماری‌های آلزایمر و پارکینسون را فراهم می‌کند.

چگونه دانشمندان اطلس را گردآوری کردند

محققان داده‌های حاصل از رونوشت‌برداری، پروفایلینگ ریبوزوم و طیف‌سنجی جرمی را با هم ترکیب کردند. روش اول به ما امکان می‌دهد تا مشخص کنیم کدام نواحی ژنوم در سلول‌ها رونویسی می‌شوند، روش دوم تعیین می‌کند که کدام توالی‌ها برای سنتز پروتئین استفاده می‌شوند و روش سوم حضور فیزیکی قطعات پروتئینی را در بافت تأیید می‌کند.

این مطالعه بر روی نمونه‌هایی از قشر پیش‌پیشانی پشتی-جانبی، ناحیه‌ای از لوب پیشانی مرتبط با حافظه، برنامه‌ریزی، توجه و تصمیم‌گیری، متمرکز بود. این مطالعه شامل موادی از چندین مجموعه مغز انسان پس از مرگ بود. در مجموع ۶۱۰ نمونه از طریق خط لوله پروتئوژنوم پردازش شدند که ۶۰۸ مورد از آنها معیار‌های کیفیت را داشتند. برای تجزیه و تحلیل مقایسه‌ای محتوای میکروپروتئین، دانشمندان ۴۸۰ نمونه از مطالعه فرامین مذهبی و پروژه حافظه و پیری را انتخاب کردند.

از این تعداد، ۱۱۱ نفر متعلق به افرادی بودند که به بیماری آلزایمر مبتلا نبودند، ۱۸۲ نفر به افرادی که تغییرات پاتولوژیک مشخصی در مغز داشتند، اما هیچ علامت مادام‌العمر زوال عقل نداشتند و ۱۸۷ نفر دیگر به بیمارانی که تغییرات پاتولوژیک و تظاهرات بالینی بیماری را داشتند. میانگین سنی اهداکنندگان در این بخش از مطالعه تقریباً ۸۸ سال بود.

دانشمندان داده‌های موجود را با استفاده از برنامه‌های کامپیوتری خود دوباره پردازش کردند. به طور خاص، آنها از ابزار یادگیری ماشینی ShortStop که توسط آزمایشگاه ساگاتلیان توسعه داده شده بود، استفاده کردند. این ابزار، چارچوب‌های خواندن باز کوچک (فریم‌های خواندن باز) - مناطقی از کد ژنتیکی که پتانسیل تولید میکروپروتئین‌ها را دارند - را تجزیه و تحلیل می‌کند.

این الگوریتم توالی اسید آمینه و خواص فیزیکوشیمیایی مولکول‌های مشکوک را در نظر می‌گیرد. این الگوریتم طوری آموزش داده شده است که پروتئین‌های کوتاه شناخته شده را از توالی‌های مصنوعی ایجاد شده با ویژگی‌های مشابه تشخیص دهد.

محاسبات به تنهایی کافی نبودند. دانشمندان برای تأیید وجود مولکول‌های کشف‌شده، پیش‌بینی‌های خود را با نتایج طیف‌سنجی جرمی مقایسه کردند. اساساً، محققان قطعات پروتئینی شناسایی‌شده به صورت تجربی را با آنچه طیف آنها طبق مدل کامپیوتری باید به نظر می‌رسید، مقایسه کردند. این رویکرد جامع به کاهش احتمال اشتباه گرفتن یک سیگنال تصادفی با یک میکروپروتئین کمک کرد.

چند میکروپروتئین کشف شد؟

در مجموع، دانشمندان ۳۰۰۱ میکروپروتئین را که در بخش داوری‌شده توسط همتا در پایگاه داده UniProtKB وجود نداشتند، تجزیه و تحلیل کردند. داده‌های طیفی با اطمینان بالا برای ۱۰۶۷ مولکول به دست آمد. ۱۴۳۳ میکروپروتئین دیگر نیز رتبه اطمینان متوسطی دریافت کردند و نیاز به تأیید بیشتر دارند.

بسیاری از ۱۰۶۷ میکروپروتئینی که وجودشان با اطمینان بیشتری تأیید شده است، قبلاً در بافت مغز انسان شناسایی نشده‌اند. با این حال، محققان ادعا نمی‌کنند که همه مولکول‌های کشف‌شده لزوماً عملکرد‌های بیولوژیکی مستقلی را انجام می‌دهند. این اطلس در درجه اول وجود آنها را تأیید می‌کند و مبنایی برای آزمایش‌های بعدی فراهم می‌کند.

مشکل این بود که ۸۱۴ مورد از ۱۰۶۷ میکروپروتئین را می‌توان تنها با استفاده از یک پپتید منحصر‌به‌فرد تأیید کرد. با استفاده از قانون استاندارد که نیاز به تشخیص دو پپتید دارد، بیشتر این مولکول‌ها شناسایی نمی‌شدند. بنابراین، نویسندگان علاوه بر این بررسی کردند که آیا مناطق مربوطه ژنوم توسط ریبوزوم‌ها خوانده می‌شوند یا خیر و توافق بین طیف‌های ثبت شده و پیش‌بینی شده را ارزیابی کردند.

تقریباً سه چهارم میکروپروتئین‌های کشف‌شده توسط مناطقی از ژنوم رمزگذاری شده‌اند که پیش از این تصور می‌شد مسئول تولید پروتئین‌های بزرگ‌تر هستند. این بدان معناست که یک منطقه ژنتیکی می‌تواند چندین محصول مختلف ایجاد کند که برخی از آنها در مدل‌های سنتی در نظر گرفته نشده بودند.

در برخی موارد، مقدار میکروپروتئین مستقل از محتوای پروتئین اصلی کدگذاری شده توسط همان ژن تغییر کرد. بنابراین، تجزیه و تحلیل در سطح ژن یا پروتئین بزرگ به تنهایی ممکن است تمام تغییرات مولکولی رخ داده در بیماری‌های نورودژنراتیو را نشان ندهد.

چگونه میکروپروتئین‌ها در بیماری آلزایمر متفاوت بودند

نویسندگان نمونه‌هایی از افراد سالم و بیماران مبتلا به بیماری آلزایمر علامت‌دار را مقایسه کردند. در دقیق‌ترین مدل، که در آن میکروپروتئین باید حداقل در نیمی از نمونه‌ها شناسایی می‌شد، دانشمندان ۲۲ مولکول را که قبلاً در پایگاه داده آزمایش‌شده وجود نداشتند، شناسایی کردند که سطوح آنها از نظر آماری بین گروه‌ها تفاوت معنی‌داری داشت.

با گسترش معیارها، تعداد میکروپروتئین‌هایی که به طور بالقوه با این بیماری مرتبط بودند، افزایش یافت. یک تجزیه و تحلیل جستجوی کمتر دقیق، تا ۲۵۸ کاندید را شناسایی کرد. با این حال، این نتایج نیاز به تأیید بیشتر دارند، زیرا کار با هزاران مولکول کوتاه، خطر تصادفات تصادفی را افزایش می‌دهد.

محققان همچنین ۹۹ پروتئین کوتاه شناخته‌شده را شناسایی کردند که سطح آنها بین بافت مغز افراد مبتلا به آلزایمر و افراد سالم متفاوت بود. برخی از این تغییرات با نتایج مطالعات قبلی مطابقت داشت و دقت سیستم توسعه‌یافته را بیشتر تأیید می‌کرد.

با این حال، تفاوت‌ها همیشه قابل توجه نبودند. نویسندگان تأکید کردند که بافت مغز پس از مرگ از انواع مختلفی از سلول‌ها تشکیل شده است، بنابراین تغییرات مشخصه یک جمعیت سلولی خاص ممکن است هنگام تجزیه و تحلیل کل نمونه کمتر مورد توجه قرار گیرد.

دانشمندان توجه ویژه‌ای به میکروگلیا، سلول‌های ایمنی سیستم عصبی مرکزی، داشتند. آنها سلامت بافت مغز را کنترل می‌کنند، سلول‌های آسیب‌دیده را حذف می‌کنند و در پاسخ التهابی شرکت می‌کنند. با افزایش سن و در بیماری‌های عصبی، عملکرد میکروگلیا می‌تواند مختل شود.

آنچه دانشمندان در میکروگلیا کشف کرده‌اند

در میان مولکول‌های بالقوه مهم، محققان یک میکروپروتئین به طول ۶۳ اسید آمینه به نام میکرو-MKKS۶۳ را شناسایی کردند. این میکروپروتئین توسط یک چارچوب خواندن کوتاه (SRF) در ژن MKKS کدگذاری می‌شود.

پیش از این، این ناحیه ژنومی عمدتاً به خاطر وجود یک پروتئین بزرگتر به طول ۵۷۰ اسید آمینه شناخته شده بود. با این حال، در نمونه‌های قشر پیشانی، محققان تقریباً هیچ مدرکی دال بر تولید این پروتئین بزرگ پیدا نکردند. برعکس، مشخص شد که Micro-MKKS۶۳ محصول پروتئینی غالب این ناحیه ژنتیکی است.

در بیماران مبتلا به بیماری آلزایمر علامت‌دار، سطح micro-MKKS۶۳ کمتر از افراد سالم بود. با این حال، سطح رونوشت‌های کدکننده پروتئین بزرگ MKKS تغییر قابل توجهی نکرد. این موضوع تأیید کرد که این میکروپروتئین می‌تواند جداگانه از محصول اصلی همان ژن تنظیم شود.

تجزیه و تحلیل بیشتر نشان داد که micro-MKKS۶۳ با عملکرد میتوکندری - ساختار‌های درون سلولی که واسطه تولید انرژی هستند - مرتبط است. محققان این میکروپروتئین را در ناحیه میتوکندری سلول‌های میکروگلیای انسانی کشف کردند.

سپس، با استفاده از سیستم ویرایش ژنوم CRISPR-Cas۹، دانشمندان تنها چارچوب خواندن کوتاه مسئول micro-MKKS۶۳ را مختل کردند، در حالی که ناحیه کدگذاری پروتئین بزرگ MKKS را حفظ کردند.

پس از حذف این میکروپروتئین، مصرف اکسیژن پایه، حداکثر سرعت تنفس و تولید انرژی مرتبط با ATP در دو رده سلولی تولید شده به طور مستقل کاهش یافت. این یافته‌ها نشان می‌دهد که micro-MKKS۶۳ برای فسفوریلاسیون اکسیداتیو طبیعی، یکی از مکانیسم‌های اصلی تولید انرژی سلولی، ضروری است.

بنابراین، کاهش سطح micro-MKKS۶۳ ممکن است با عدم تعادل انرژی در میکروگلیا‌ها در بیماری آلزایمر مرتبط باشد. با این حال، هنوز مشخص نیست که آیا فقدان این میکروپروتئین در ایجاد بیماری نقش دارد یا نتیجه فرآیند‌های پاتولوژیک موجود است.

چرا این کشف برای تحقیقات ژنوم مهم است؟

این مطالعه نشان می‌دهد که نقشه فعلی پروتئوم انسان ناقص است. دانشمندان ژن‌ها و پروتئین‌های بزرگ زیادی را به طور کامل مطالعه کرده‌اند، اما این بدان معنا نیست که آنها می‌دانند همه مولکول‌هایی که سلول‌ها قادر به تولید آنها هستند، چیستند.

ساگاتلیان تأکید کرد: «گاهی اوقات فرض می‌شود که ما همه چیز را در مورد ژنوم خود و تمام پروتئین‌هایی که سلول‌های ما می‌توانند تولید کنند می‌دانیم. این به سادگی درست نیست.»

کشف میکرو-MKKS۶۳ همچنین نشان می‌دهد که پروتئین «اصلی» یک ژن که به طور سنتی جدا شده است، لزوماً محصول اصلی آن در همه بافت‌ها نیست. در سلول‌های مغز، یک مولکول کوتاه‌تر و قبلاً کمتر مورد مطالعه قرار گرفته، ممکن است به طور قابل توجهی فعال‌تر از پروتئین بزرگ‌تری که قبلاً در کتاب‌های مرجع ذکر شده است، تولید شود.

این امر برای یافتن نشانگر‌های زیستی و اهداف درمانی مهم است. اگر دانشمندان فقط یک پروتئین متعارف را مطالعه کنند، ممکن است محصول دیگری از همان ژن را که ارتباط قوی‌تری با عملکرد یک نوع سلول یا بیماری خاص دارد، از دست بدهند.

این اطلس به محققان اجازه می‌دهد تا مشخص کنند کدام میکروپروتئین‌ها در سلول‌های مغز وجود دارند، سطح آنها در طول پیری و تخریب عصبی چگونه تغییر می‌کند و کدام مولکول‌ها شایسته مطالعه عملکردی خاص هستند. نویسندگان داده‌های بیان، ارزیابی‌های پایایی طیفی و برنامه‌های پردازش اطلاعات را در دسترس قرار داده‌اند.