نتایج امیدبخش درمان سرطان و کرونا با روش کریسپرپایه/پیشنهاد محققان برای توسعه کریسپر در کشور

به گزارش مجله خبری نگار،دکتر محمود تولایی، استاد دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج) و رئیس انجمن ژنتیک ایران گفت: با افزایش آگاهی بشر از ساختار ژن‌­های تشکیل دهنده صفات و ویژگی‌های موجودات زنده، کاربرد‌های نوینی برای آن شناخته می‌شود. افزایش دقت در تشخیص علل و عوامل بوجودآورنده بیماری‌ها، نقایص و اختلالات ژنتیکی و عوامل مؤثر در بروز صفات گوناگون از جمله رنگ پوست، چشم، رنگ و حالت مو و تمامی صفات دیگر میسر شده است.

وی با تاکید بر اینکه بموازات آن، تلاش برای حذف علل بیماری‌­ها و اختلالات و کشف دارو‌های مؤثر بر فعال سازی و یا غیرفعال سازی مسیر‌های ژنی مؤثر در بیماری هم، مورد توجه قرار گرفته است، ادامه داد: از اوایل دهه ۱۹۹۰، پتانسیل درمان‌­های جدید مبتنی بر مهندسی و اصلاح ژن و سلول نیز، انقلابی در حوزه‌های پزشکی و کشاورزی ایجاد کرده است و هدف ژن درمانی، اصلاح نقائص ژنتیکی و یا بیان محصولات ژنی است که از نظر درمانی، مفید به نظر می‌رسند؛ از این رو امروزه برای ژن ­درمانی روش‌های مختلفی طراحی شده است که یکی از آن‌ها سیستم برپایه کریسپر است.

تولایی، "ویرایش ژنوم" را دستکاری دقیق توالی‌های DNA سلولی توصیف کرد و یادآور شد: این فرایندی است که از آن می‌توان سرنوشت سلول‌ها و ویژگی‌های ژنتیکی موجودات زنده را تغییر داد و این فرایند می‌تواند به ما در درک بهتر ژنتیک انسانی و درمان بیماری‌های ژنتیکی کمک شایانی کند.

اجزای تشکیل دهنده فناوری کریسپر

رئیس انجمن ژنتیک ایران خاطر نشان کرد: در سال ۲۰۱۲ میلادی برای اولین بار نشان داده شد که سیستم کریسپر (CRISPR) که یکی از اجزاء مهم سازنده سیستم ایمنی بدن در مواجهه با باکتری‌ها و ویروس‌ها است، می‌تواند از طریق برش هدفمند DNA عمل کند. سیستم ویرایش ژنومی کریسپر در ساده‌ترین حالت خود، از یک "اندونوکلئاز" غیر اختصاصی (Cas ۹) جهت برش ژنوم و از یک آر ان‌ای راهنمای (gRNA) کوچک، جهت هدایت این نوکلئاز به سمت جایگاه برش از پیش مشخص شده توسط کاربر، عمل می‌کند.

وی اضافه کرد: در ویرایش ژنومی کریسپرپایه، توالی هدف می‌بایست مکمل توالی فاصله انداز ۲۰ نوکلئوتیدی آر ان‌ای راهنما (gRNA) باشد و در سمت ´۳ خود، بلافاصله بعد از جایگاهی که توسط آر ان‌ای راهنما (gRNA) هدف گیری می‌شود، دارای یک توالی "پم" (PAM) باشد. تنها در چنین شرایطی است که آر ان‌ای راهنما (gRNA) اندونوکلئاز Cas ۹ را به محل توالی هدف برده و برش دو رشته‌ای دی ان‌ای هدف، به دست می‌آید.

وی ادامه داد: این برش ایجاد شده کریسپری، می‌تواند ازطریق پیوند انتهای غیر هومولوگ (NHEJ) ترمیم شود و اگر یک الگوی ترمیمی (Repair Templet) فراهم شود، محل برش دی ان‌ای می‌تواند از طریق فرایند هدایت شده هومولوگ (HDR) ترمیم شود و امکان یک ویرایش ژنی دقیق و بی نقص را فراهم آورد.

این استاد دانشگاه بقیه الله به بیان گزینه‌های انتقال اجزاء کریسپر پرداخت و توضیح داد: در ویرایش ژنومی کریسپر- پایه، آنزیم‌های کریسپری، RNA راهنما‌ها و الگو‌های ترمیمی (در مواقعی که نیاز به اعمال ترمیم هدایت شده هومولوگ است) می‌بایست به درون سلول‌هایی که نیاز به ویرایش دارند، انتقال داده شوند و معمولا این انتقال در سه فرمت DNA، آر ان‌ای پیام رسان و آر ان‌ای راهنما و یا پروتئین و آر ان‌ای راهنما به داخل سلول‌های اندام هدف انتقال یابند. در کار‌های بالینی برای انتقال این اجزا از وکتور‌های ویروسی، نانو ذرات و الکتروپوریشن مجموعه‌ای از پروتئین و آر ان ای، کمک گرفته می‌شود.

محدودیت فناوری کریسپر: ضرورت توالی پم (PAM)

وی توالی پم (PAM) را یک توالی ژنومی ۳ تا ۵ نوکلئوتیدی دی ان ای دانست که برای آنزیم Cas ۹ به عنوان یک علامت اتصالی عمل می‌کند و گفت: آنزیم‌های مشابه Cas ۹ مشتق شده از موجودات مختلف، یا آنزیم‌های Cas ۹ جهش یافته و تهیه شده در آزمایشگاه‌های مختلف، به توالی‌های پمی (PAM) متفاوتی وابسته هستند. این تفاوت‌ها، به پژوهشگران اجازه می‌دهند نقاط ژنومی وسیع‌تر و متفاوتی را مورد هدف ویرایشی خود قرار دهند.

تولایی خاطر نشان کرد: به وضوح مشخص شده است که ویرایش ژنومی توسط CRISPR/Cas ۹ می‌تواند به تغییرات ناخواسته بر روی نقاط غیر هدف، منجر شود. روش‌های کاهش این تغییرات ناخواسته که "اثرات برش نابجا" نامیده می‌شوند، شامل استفاده از Cas ۹ گونه Nikase، کاهش بیان آنزیم Cas ۹ و کوتاه کردن توالی آر ان‌ای راهنمای (gRNA) به کار برده شده برای هدف‌گیری می‌شود و اخیرا دو واریته کریسپری eSpCas ۹ و SpCas ۹-HF ۱ کشف شده است که از طریق استفاده از آن‌ها عملکرد اختصاصی نوکلئاز Cas ۹ بر روی اهداف مد نظر بهبود یافته است.

استاد دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج) یادآور شد: ویرایش ژنومی غیر دقیق بر روی اهداف نامطلوب زمانی شکل می‌گیرد که این توالی‌ها شباهت زیادی به توالی اهداف مطلوب داشته باشند. استفاده از رویکرد‌های ویرایشی ژنوم در مطالعات بالینی منوط به میزان دقت اعمال آن ویرایش دارد. این میزان از دقت به نسبت اهداف مطلوب در برابر اهداف نامطلوب و همچنین به درصد ویرایش شکل گرفته بر روی اهداف مطلوب بستگی دارد.

وی با بیان اینکه این مخاطرات سبب شده است که توسعه فناوری کریسپر به سمت و سویی سوق داده شود که در آن از برش DNA ژنومی دوری شود، نظیر فناوری CRISPR interference و CRISPR activation که در هر دو مورد از آنزیم Cas ۹ [۲]مرده استفاده می‌شود، گفت: همچنین در این راستا سیستم‌های کریسپری دیگری نیز در حال توسعه هستند که تغییرات ژنومی را به صورت "اپی ژنیک" اعمال می‌کنند تا بیان ژن را تحت کنترل بگیرند.

تولایی اظهار کرد: از دیگر مشکلاتی که در رابطه با استفاده از فناوری کریسپر در امور بالینی وجود دارد، ایمنی زایی پروتئین‌های ویرایشی هست که از باکتری‌ها مشتق شده‌اند. این ایمنی زایی آنزیم‌های کریسپری می‌تواند از طریق اعمال تنها یک درمان ویرایشی بسیار کارآمد تک مرحله‌ای مدیریت شود، همچنین استفاده از آنزیم‌های ویرایشی مختلف نیز می‌تواند از بروز این شرایط نامطلوب جلوگیری کند.

به گفته وی همچنین نشان داده است که عدم دقت در بهینه سازی اعمال ویرایش کریسپری نیز می‌تواند منجر به غیر فعال شدن مسیر p ۵۳ شود.

این استاد حوزه زیست فناوری تاکید کرد: با وجود تمامی مشکلات و مخاطراتی که به آن اشاره شد، گزارشات اخیر راجع به بیمار مبتلا به HIV که به وسیله دریافت سلول‌های بنیادی خون ساز ویرایش شده، تحت مداوا قرار گرفته بود، نشان داد که با گذشت تقریبا دو سال نتیجه نامطلوبی که بتوان آن را به ویرایش ژنومی کریسپری تعمیم داد، مشاهده نشد. به طور کلی این یافته‌ها نشان می‌دهند که در حال حاضر در زمینه مسائل مربوط به ویرایش ژنوم انسان‌ها و توسعه کاربرد‌های بالینی مؤثر و ایمن موانعی وجود ندارد که نتوان از عهده آن بر آمد.

ژن درمانی کریسپر پایه از طریق ایمونوتراپی

رییس انجمن ژنتیک ایران با بیان اینکه در سال ۲۰۱۸ میلادی با صدور مجوز FDA اولین مطالعات بالینی مرتبط با درمان کریسپر-پایه سرطان شروع شد، گفت: در این مطالعات از فناوری CRISPR/Cas ۹ جهت ویرایش سلول‌های T بیمارانی که هیچ گزینه درمانی دیگری نداشتند، استفاده شد و در این مطالعه لنفوسیت‌های T از خون بیماران دریافت شدند و در محیط ex vivo به وسیله فناوری CRISPR/Cas ۹ به شکلی مهندسی شدند که گیرنده‌های سلولی T مخصوص به تومور را بیان کنند.

وی با تاکید بر اینکه این سلول‌ها متعاقبا به داخل بدن بیمار تزریق شدند، اضافه کرد: نتایج رضایت بخش این روش درمانی چنان تاثیرگذار بود که از آن تاریخ به بعد تعداد زیادی از مطالعات بالینی با استفاده از فناوری کریسپر در انواع مختلفی از بیماران سرطانی مورد توجه قرار گرفته است.

ژن درمانی کریسپر پایه از طریق اخلال ژنی

استاد دانشگاه علوم پزشکی دانشگاه بقیه الله به کاربردی شدن فناوری کریسپر از طریق اخلال ژنی اشاره کرد و افزود: در این حوزه اولین مطالعات بالینی مربوط به بیمارانی بود که از کم خونی "داسی شکل" و تالاسمی "بتا" رنج می‌بردند. در این نوع از درمان سطح هموگلوبین F را افزایش می‌دهند و در نتیجه یک یا دو جایگاه از چهار جایگاه اتصال هموگلوبینی بر روی "اریتروسایت‌"ها اشغال می‌شود. این رویکرد در بهبود بیماری‌های هموگلوبینی مهم نظیر کم خونی داسی شکل و تالاسمی بتا نقش مهمی ایفا می‌کند.

وی ادامه داد: در این رویکرد سلول‌های بنیادی خونساز از خون خود بیمار جدا و با استفاده از فناوری کریسپر در ژن BCL ۱۱ A این سلول‌ها اخلال ایجاد می‌شود و در نتیجه سطح بیان هموگلوبین F افزایش می‌یابد. متعاقبا پس از از بین بردن سلول‌های بنیادی خون ساز ویرایش نشده در مغز استخوان بدن بیمار، این سلول‌های بنیادی پیرایش شده به صورت وریدی به بدن بیمار تزریق می‌شوند.

تولایی تاکید کرد: نتایج این مطالعات بالینی به قدری امیدوارکننده است که پژوهشگران در حال حاضر در حال ارزیابی خطرات بلند مدت و مزایای این روش درمانی جدید هستند.

ژن درمانی کریسپر پایه در محیط درون تنی

رئیس انجمن ژنتیک اضافه کرد: اگر چه ویرایش‌های ژنی در محیط درون تنی به علت عدم دسترسی مناسب به بافت‌های هدف محدود شده است، اما تعداد کمی از اندام‌ها نظیر چشم این شرایط را فراهم آورده است. بیماری "لبر آموروزیس" مادرزادی (LCA) یک بیماری چشمی مونوژنیک است که در کودکی سبب کوری می‌شود. عامل این بیماری جهش از بین برنده کارایی تک "اللی" در ژن CEP ۲۹۰ است که درمانی برای آن وجود ندارد. در مطالعه بالینی که صورت گرفت، اجزای سیستم CRISPR/Cas ۹ مستقیما به داخل شبکیه چشم بیمار انتقال داده شدند که نهایتا منجر به بیان پروتئین سالم و کارآمد شد.

وی تصریح کرد: اگرچه نتایج این مطالعه بالینی رضایت بخش است، اما با این حال می‌بایست پتانسیل بوجود آمدن ایمونوتوکسیسیتی و اثرات اهداف نابجا و نامطلوب در این روش مورد بررسی و ارزیابی قرار گیرد. با تمام این تفاصیل درمان درون تنی کوری به وسیله فناوری کریسپر گام بزرگی است برای استفاده هر چه بیشتر کریسپر در حوزه مرتبط با ژن درمانی.

ویرایش کریسپری جنین انسان

تولایی با بیان اینکه در مورد ویرایش ژنوم سلول‌های غیر جنسی هر گونه عواقب ناشی از آن ویرایش پس از اخذ رضایتمندی از بیمار منحصر به خود فرد بیمار است، گفت: حال آنکه در مورد ویرایش ژنوم سلول‌های جنسی نه تنها ما به لحاظ حقوقی رضایت افرادی که متعاقبا به دنیا می‌آیند را نداریم، بلکه تمامی عوارض جانبی و دائمی ناشی از ژن درمانی را به نسل‌های آینده منتقل می‌کنیم. با این حال مطالعه کریسپر-پایه بحث برانگیزی که اخیرا بر روی جنین انسان صورت گرفت، واکنش‌های قابل ملاحظه‌ای در خصوص استاندارد‌های اخلاقی مربوط به این قبیل ویرایش‌های ژنومی بوجود آورده است.

وی یادآور شد: در این مطالعه بنیادین ژن CCR ۵ جنین انسان با هدف ایجاد مقاومت دربرابر HIV مورد مهندسی ژنتیکی واقع شد؛ چرا که به طور طبیعی در بعضی از افراد، جهش ژن CCR ۵ سبب بروز این مقاومت می‌شود. در این مطالعه دو جنین که در یکی، هر دو نسخه و در دیگری، تنها یکی از دو نسخه ژن مربوطه ویرایش شده بود، مجددا در بدن مادر کاشته شدند و این مهم در حالی صورت گرفت که کماکان از ایجاد مقاومت در برابر HIV اطمینان کاملی حاصل نشده بود.

این استاد دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله خاطر نشان کرد: احتمال بروز اثرات مادام العمر اهداف نابجا و نامطلوب، از دیگر نگرانی‌های استفاده از این رویکرد در مطالعات انسانی است. پیشرفت‌های اخیری هم در زمینه توسعه ابزار‌های ویرایشی کریسپری، جهت کاهش اثرات اهداف نابجا و نامطلوب، صورت گرفته است، نظیر استفاده از دیگر واریته‌های آنزیم Cas ۹ که از کارآمدی بهتری برخوردارند، بوجود آمده است؛ لکن هنوز این روش‌ها متداول نشده‌اند.

کریسپر و پاندمی کرونا

تولایی با بیان اینکه علاوه بر کاربرد تشخیصی کریسپر، این فناوری می‌تواند گزینه مناسبی جهت درمان بیماران کرونایی باشد، توضیح داد: آنزیم Cas ۱۳ یک اندونوکلئاز هدفگیر مولکول RNA است و در این راستا می‌تواند به وسیله RNA راهنما هدایت شود.

به گفته وی، کشف این آنزیم این پتانسیل را بوجود آورده است که بتوان از آن به عنوان یک ابزار درمانگر در برابر COVID-۱۹ استفاده کرد.

این استاد دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله ادامه داد: سیستم PAC-MAN از واریته‌ای از آنزیم Cas ۱۳ بهره می‌برد که بخاطر اندازه کوچک آن عملا نه تنها جاگیری آن را در وکتور‌های ویروسی تسهیل می‌کند، بلکه در سلول‌های انسانی به آن عملکرد تخصصی و قدرت کاتالیکی بیشتری می‌دهد. این روش به منظور هدف گیری همزمان چندین ناحیه ژنتیکی و در راستای تجزیه RNA توسعه یافته است؛ بنابراین با توسعه این روش، محتمل است که ساز و کار سیستم CRISPR/Cas بتواند به وظیفه اصلی خود که همانا مبارزه با ویروس است، مبادرت ورزد و از این طریق به بشریت کمک کند.

ملاحظات اخلاقی پیرامون ویرایش ژن‌های انسانی

رییس انجمن ژنتیک با تاکید بر اینکه در حال حاضر به نظر می‌رسد با وضع قوانین مناسب و پایبندی به آن می‌توان به پژوهش‌های پایه و پیش بالینی در زمینه‌های ویرایش سلول‌های جنسی و غیر جنسی ادامه داد، گفت: کاربرد‌های بالینی سلول‌های غیر جنسی ارزشی بالقوه و آینده‌ای نویدبخش دارند، اما احتمال بروز خطراتی از قبیل ویرایش اهداف نابجا، می‌بایست همراه با فواید ویرایش هدفمند، مورد سنجش قرار گیرند و اینکه این کار باید در چارچوب وضع قوانین دقیق ژن درمانی صورت پذیرد.

وی ادامه داد: گسترش اخیر آنزیم‌های جدید و ارتقاء یافته کریسپری و همچنین افزایش کار‌های پژوهشی، به پیشرفت و بهبود ویرایش کریسپری کمک می‌کند تا توسعه کاربرد‌های کلینیکی بر روی سلول‌های غیر جنسی بیشتر از پیش توسعه یابد.

تولایی معتقد است که برای رسیدن به یک اجماع اجتماعی در زمینه چگونگی استفاده از فناوری کریسپر، مسیر دور و درازی در پیش است، خصوصا تا زمانی که این فناوری به سمت ویرایش بالینی سلول‌های جنسی پیش برود و یادآور می‌شود، اگرچه بعضی از پژوهشگران، طرفدار ویرایش رده‌های سلولی جنسی هستند، اما گروهی دیگر نگرانند که مبادا مناقشات مرتبط با ویرایش سلول‌های جنسی، باعث توقف مقبولیت کاربرد‌های بالینی ویرایش سلول‌های غیر جنسی شود. از آنجایی که، ذهن جامعه با این قبیل از مسائل اخلاقی درگیر است، مراودات و ارتباطات شفاف علمی، جهت اطمینان بخشی به جامعه ضروری است تا عامه مردم، هم فواید و هم مخاطرات کاربرد‌های انسانی کریسپر را درک کنند.

وی تاکید کرد: جمهوری اسلامی ایران با برخورداری از دانشمندان برجسته و متعهد و در اختیار داشتن زیرساخت‌های خوب تحقیقاتی، درصورت حمایت هوشمندانه مسئولین، در کنار توجه به ابعاد اخلاق زیستی مبتنی بر شرع دین مبین اسلام، می‌تواند پابه پای دانشمندان موفق در عرصه‌های تولید دانش جهانی، در عرصه‌های نوین ژنتیک و بیوتکنولوژی برای پاسخ به نیاز بشر در زمینه‌های پزشکی، کشاورزی مولکولی و ... سربلند و افتخارآفرین باشد.